Tên đề tài luận án: Nghiên cứu đặc điểm kháng thuốc, kiểu gen, sự truyền plasmid mang blaNDM của các chủng vi khuẩn đường ruột Gram âm lâm sàng tại TP. HCM 2010-2017
Ngành: Di truyền
Mã số ngành: 62420121
Họ tên nghiên cứu sinh: Lê Hà Tầm Dương
Khóa đào tạo: 2014
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Cao Thị Bảo Vân
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG.HCM
1. Tóm tắt nội dung luận án
Vi khuẩn (VK) kháng kháng sinh đặc biệt đa kháng đồng thời kháng carbapenem - nguồn cứu cánh trong điều trị nhiễm đa kháng khuẩn - đã và đang là vấn đề cấp bách báo động toàn cầu. Một trong những cơ chế giúp vi khuẩn kháng carbapenem là sự hiện diện của các gen mã hóa carbapenemase trong đó blaNDM, gen mã hóa New Delhi Metallo beta-lactamase (NDM), là carbapenemase được phát hiện gần đây nhất và là một trong những enzyme được quan tâm hàng đầu do chúng có thể lan truyền qua trung gian plasmid giữa các VK nhờ cơ chế tiếp hợp. Đặc biệt, VK mang blaNDM thường đa kháng hoặc toàn kháng do chúng có khả năng tiếp nhận các gen kháng khác thông qua các yếu tố di truyền động, dẫn đến sự biến động và đa dạng di truyền vùng quanh gen blaNDM. Các đăc điểm trên có thể đã giúp blaNDM nhanh chóng lan rộng trên toàn thế giới. Đến nay có ít nhất 24 biến thể NDM lưu hành trên khoảng 200 loại plasmid ở các dòng ST khác nhau thuộc 11 họ VK. Mặc dù NDM đã tồn tại phổ biến tại nước ta và gây hậu quả nghiêm trọng trong lâm sàng nhưng các kết quả phân tích di truyền VK mang blaNDM ở nước ta vẫn còn khiêm tốn. Do đó, mục tiêu của luận án này là nghiên cứu đặc điểm kháng thuốc, kiểu gen, các yếu tố góp phần lan truyền plasmid mang gen blaNDM ở nước ta, trả lời cho các câu hỏi nghiên cứu: 1) Tính đa dạng di truyền vùng trình tự xung quanh gen blaNDM ở nước ta có vai trò như thế nào trong việc lan truyền gen kháng? 2) Có sự biến động di truyền của vùng gen blaNDM đi kèm với tần suất lan truyền của chúng theo thời gian không? 3) Có hay không dòng ST phổ biến ở mỗi loài VK mang blaNDM? Việc lan truyền blaNDM có dễ dàng giữa các loài khác nhau?
Để đạt được các mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện các thí nghiệm trên nhóm VK đường ruột Gram âm lâm sàng kháng carbapenem, gốm: Phân lập, xác định kiểu hình kháng KS, sàng lọc chủng mang gen blaNDM; Nghiên cứu các đặc trưng di truyền của các chủng đại diện bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới và sử dụng các công cụ tin sinh học để: (i) Xác định các dạng biến thể NDM; (ii) Xác định nhóm plasmid mang gen blaNDM; (iii) Phân tích đặc điểm cấu trúc, thành phần của vùng gen blaNDM và (iv) Xác định dòng ST của các chủng và phân tích đặc điểm chuyển gen blaNDM qua cơ chế tiếp hợp.
Tổng cộng 142 chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem đã được phân lập tại 4 bệnh viện ở TPHCM trong thời gian 2010-2017, nhiều nhất là nhóm chủng K. pneumoniae (75%). Có 64/142 (45%) chủng cho kết quả dương tính blaNDM. Tỷ lệ chủng mang NDM tăng mạnh kể từ 2015 (từ 50% lên 74%). Tất cả các chủng thu nhận đều cho kiểu hình kháng/trung gian với hầu hết các loại kháng sinh được sử dụng trong điều trị hiện nay. Có 2 biến thể NDM ở các chủng nghiên cứu: NDM-1 (8/17 chủng) và NDM-4 (9/17 chủng), trong đó NDM-4 dần thay thế NDM-1 kể từ 2015, có hoạt tính cao hơn NDM-1. Bên cạnh đó, chúng tôi ghi nhận 6 nhóm plasmid mang blaNDM, nhiều nhất là IncF (11/17) (gồm IncFII(Yp), IncFII(K) và IncFIA), các nhóm còn lại có IncC, IncX3 và IncHI2. Ngoài ra, các kết quả thu được cũng trả lời cho các câu hỏi nghiên cứu:
1) Tính đa dạng di truyền cấu trúc vùng gen blaNDM đã góp phần giải thích cho khả năng lan truyền nhanh rộng gen kháng blaNDM. Có ít nhất bốn phần tử IS khác nhau liên quan đến việc chuyển vị blaNDM cũng như các gen kháng kháng sinh khác. Các phần tử chuyển vị và các loại plasmid tương ứng của chúng là ISCR21/IS3000 và/hoặc IS26 trên IncX3 và IncFII(K); ISCR21 trên IncFIIY(p); ISCR1 và/ hoặc IS26 trên IncC và IncFIA; và IS3000 trên IncHI2. Đặc biệt ghi nhận số lượng gen kháng gia tăng đột biến ở những chủng mang blaNDM, sự đa dạng các nhân tố di truyền động xung quanh vùng gen blaNDM có thể đã góp phần sát nhập các gen kháng này. Ngoài ra, được ghi nhận ở hầu hết plasmid trong nghiên cứu, nhân tố chuyển vị Tn5403, một loại transposon nhóm Tn3, được chứng minh có mang enzyme có thể hỗ trợ plasmid không tiếp hợp trở nên tiếp hợp, qua đó làm gia tăng hả năng lan truyền giữa các vi khuẩn.
2) Trong nghiên cứu của chúng tôi, gen blaNDM-4 có thể đã liên kết với plasmid IncF chủ yếu ở K. pneumoniae các ST15 và ST16 xuất hiện từ 2014, 2015. NDM-4 là biến thể có kiểu hình kháng ưu thế hơn NDM-1, IncF là nhóm plasmid có khả năng tiếp hợp, ST15 và ST16 là các dòng ST quốc tế ưu thế đã được ghi nhận trên thế giới. Như vậy, đã có sự tiến hóa, thích nghi của dòng ST K. pneumoniae mang blaNDM thành dòng ưu thế trong nghiên cứu của chúng tôi.
3) Ở E. coli: Dòng ST405 lưu hành ở cả 3 Bệnh viện (BV) các năm 2015, 2017; dòng ST648 mang plasmid IncHI2, NDM-1 lưu hành ở BV ND2 năm 2015, 2017; dòng ST101 mang plasmid IncFIIY(p), NDM-1 lưu hành ở BV BD 2013, 2015 và dòng ST410 lưu hành ở BV ND1 năm 2017 là các dòng được ghi nhận. Ở K. pneumoniae: Dòng ST15 và ST16 mang plasmid IncF, NDM-4 là dòng chiếm ưu thế ở BV ND2 năm 2015, 2017, dòng ST983 là dòng được ghi nhận nhiều ở BV ND1 năm 2015. Về việc lan truyền blaNDM (qua cơ chế tiếp hợp), kết quả nghiên cứu cho thấy gen blaNDM có thể được truyền từ K. pneumoniae/E. coli sang E. coli (J53) với tần suất trung bình 10-4 – 10-6. Việc tiến hành tiếp hợp trên nhiều loài khác cũng như khảo sát các cơ chế chuyển gen khác ngoài tiếp hợp nên được thực hiện trong những nghiên cứu tiếp theo.
Ngoài ra, có hai kết quả của đề tài lần đầu tiên được ghi nhận trong y văn: 1) Trình tự chèn ISKpn19 và transposon Tn6901 trong vùng trình tự gen blaNDM-1 ở chủng Res10BD-27; việc chèn thêm này kéo theo một loạt các gen kháng khác như adh, glo, fgh có thể đã góp phần gia tăng kiểu hình kháng của chủng này. 2) Hai kiểu trình tự ST mới, hoàn toàn chưa có trong ngân hàng dữ liệu kiểu trình tự thế giới: ST6280 ở chủng Res15ND1-30 và ST6270 ở chủng Res15ND2-20.
2. Những kết quả mới của luận án
Có ba cơ chế chính trong việc thu nhận gen mã hóa carbapenemase ở VK Gram âm là lan truyền theo dòng chủng (ST), lan truyền qua cơ chế tiếp hợp plasmid và qua các yếu tố di động cho phép thu nhận và/hoặc tách rời gen kháng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi ghi nhận tất cả các cơ chế trên ở nhóm chủng nghiên cứu và cả sự kết hợp của cả ba cơ chế trên cùng nhóm chủng K. pneumoniae ST16 mang plasmid IncFII(K). Kết quả nghiên cứu đã góp phần giải thích cơ chế lan truyền gen blaNDM qua đó lý giải tỷ lệ VK kháng carbapenem tăng nhanh. Biện pháp hiệu quả nhất hiện nay nhằm giảm tỷ lệ kháng theo chúng tôi vẫn là kiểm soát tốt nhiễm khuẩn bệnh viện, liên tục giám sát các dòng ST lưu hành tại các bệnh viện để kịp thời phát hiện dòng gây dich. Nếu được, cần sàng lọc, cách ly sớm và nghiêm ngặt bệnh nhân mang vi khuẩn kháng carbapenem đặc biệt bệnh nhân chuyển viện. Để làm được việc này, cần cấp thiết phát triển các kỹ thuật chẩn đoán nhanh để xác định kiểu hình kháng KS, dòng ST gây dịch (ví dụ ST16).
3. Các ứng dụng/ khả năng ứng dụng trong thực tiễn hay những vấn đề còn bỏ ngỏ cần tiếp tục nghiên cứu
Trước tình hình VK đa kháng và kháng carbapenem không ngừng gia tăng, các kết quả của đề tài sẽ là nguồn dữ liệu cần thiết phục vụ cho công tác điều trị và quản lý lâm sàng. Để đạt hiệu quả hơn nữa, cần tăng cường hợp tác trao đổi giữa đội ngũ nghiên cứu và các y bác sĩ lâm sàng, tiếp tục thực hiện giám sát vi khuẩn kháng kháng sinh trên diện rộng với các nghiên cứu tiến cứu. Bên cạnh đó, cần tiếp tục thực hiện giải trình tự gen và phân tích đặc điểm di truyền phân tử gen kháng kháng sinh trên số lượng chủng lớn hơn, gồm cả mẫu thu thập từ môi trường, thú y và cộng đồng bên cạnh mẫu lâm sàng.