Tên đề tài luận án: Nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hoá, kháng viêm của chitooligosaccharide và dẫn xuất phenolic-chitooligosaccharide
Ngành: Hóa sinh học
Mã số ngành: 62420116
Họ tên nghiên cứu sinh: Bùi Văn Hoài
Khóa đào tạo: 2016
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Ngô Đại Nghiệp
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG.HCM
1. Tóm tắt nội dung luận án
Chitosan có những hoạt tính kháng khuẩn, giảm cholesterol, giảm huyết áp, kháng viêm, kháng oxi hóa, v.v.. Ngoài ra, chitosan là nguyên liệu dễ phân hủy sinh học, không độc vì vậy được ứng dụng rất nhiều và đa dạng trong công nghiệp dược phẩm, thực phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Tuy nhiên, chitosan không được ruột non hấp thu do hệ tiêu hóa của động vật, đặc biệt là hệ tiêu hóa của cơ thể người không có chitosanase để thủy phân chúng thành những chất có khối lượng phân tử thấp để cơ thể có thể hấp thu. Chính lý do trên, nghiên cứu cắt mạch chitosan tạo chitooligosaccharide (COS) để mở rộng phạm vi ứng dụng là rất cần thiết. Trong những năm gần đây, nghiên cứu gắn nhóm chức năng acid phenolic như acid gallic (GA), acid syringic (SA), acid caffeic (CA) và acid ferulic (FA) có hoạt tính sinh học như kháng oxi hoá, kháng viêm vào chuỗi mạch của COS để tăng cường hoạt tính sinh học và đa dạng ứng dụng của COS rất được quan tâm, qua nghiên cứu sẽ làm rõ khả năng kháng viêm và kháng oxi hóa của bốn dẫn xuất GA-COS, SA-COS, CA-COS, FA-COS. Nghiên cứu sử dụng enzym không đặc hiệu cellulase cho quá trình thủy phân chitosan nhằm thu nhận COS và quá trình tạo dẫn xuất phenolic-COS được thực hiện thông qua cặp oxy hóa khử acid ascorbic /hydrogen peroxyde. Đại thực bào RAW 264.7 được sử dụng làm mô hình in vitro để thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa như khả năng bảo vệ DNA, protein, lipid màng và hoạt tính kháng viêm thông qua con tín hiệu MAPK và NF-kB/IkB với tác nhân cảm ứng lipopolysaccharide. Phản ứng RT-PCR được sử dụng để phân tích biểu hiện các gen iNOS, COX-2 và các cytokine tiền viêm như TNF-α, IL-1β và IL-6 với trình tự mồi cho cDNA mục tiêu như iNOS: mồi xuôi 5’-CCC-TTC-CGA-AGT-TTC-TGG-CAG-CAG-C-3’, mồi ngược 5’-GGC-TGT-CAG-AGC-CTC-GTG-GCT-TTG-G-3’; COX-2: mồi xuôi 5’-GGG-GTA-CCT-TCC-AGC-TGT-CAA-AAT-CTC-3’, mồi ngược 5’-GAA-GAT-CTC-GCC-AGG-TAC-TCA-CCT-G-3’; TNF-α: mồi xuôi 5’-ATG-AGC-ACA-GAA-AGC-ATG-ATC-3’, mồi ngược 5’-TAC-AGG-CTT-GTC-ACT-CGA-ATT-3’; IL-6: mồi xuôi 5’-ATG-AGC-ACA-GAA-AGC-ATG-ATC-3’, mồi ngược 5’-TAC-AGG-CTT-GTC-ACT-CGA-ATT-3’; IL-1β: mồi xuôi 5’-ATGGCA-ACT-GTT-CCT-GAA-CTC-AAC-T-3’, mồi ngược 5’-TTT-CCTTTC-TTA-GAT-ATG-GAC-AGG-AC-3’ và gen kiểm soát glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH): mồi xuôi 5’-GCC-ACC-CAG-AAG-ACT-GTG-GAT-3’, mồi ngược 5’-TGG-TCC-AGG-GTT-TCT-TAC-TCC-3’. Phương pháp Western Blot để xác định các biểu hiện protein trong đáp ứng viêm như JNK, p38, ERK1/2 và MNK1 trong con đường MAPK và NF-kB (p50) và NF-kB (p65) trong con đường NF-kB/IkB. Kết quả nghiên cứu đã xác định được các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân như nhiệt độ 49oC, pH 5,9; nồng độ cơ chất 0,76%, hoạt độ cellulase 8,97 UI/g và thông số tối ưu trong quá trình sấy phun tạo bột COS như nhiệt độ 138oC, nồng độ chất khô 14,3%, lưu lượng nhập liệu 5,2 mL/phút. Phân tích phổ proton 1H-NMR cho thấy nghiên cứu đã tổng hợp thành công bốn dẫn xuất chitooligosaccharide ghép nhóm acid phenolic như GA-COS, SA-COS, CA-COS, FA-COS với các điều kiện thu nhận bột dẫn xuất có hoạt tính tốt nhất như tỷ lệ cơ chất COS: acid phenolic là 1:0,5, pH 5, nhiệt độ 27oC, thời gian tổng hợp là 6 giờ. COS và các dẫn xuất mới đều có khả năng kháng oxi hóa thể hiện qua hiệu quả bắt gốc tự do DPPH· và ·OH; khả năng bảo vệ DNA, protein và lipid màng trong tế bào RAW 264.7. Các dẫn xuất mới GA-COS, SA-COS, CA-COS, FA-COS cho thấy hoạt tính kháng oxi hóa được cải thiện đáng kể so COS. Trong đó có hoạt tính kháng oxi hóa của GA-COS là tốt nhất. COS và các dẫn xuất đều có vai trò là tác nhân kháng viêm thể hiện qua tác dụng làm giảm hàm lượng NO, điều hòa giảm biểu hiện gen COX-2, iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α, điều hòa giảm biểu hiện protein trong con đường tín hiệu MAPK như iNOS, ERK1/2, p38, JNK và MNK và con đường NF-kB/IkB như hai tiểu phần của NF-kB (p50 và p65), các dẫn xuất cho thấy có hiệu quả kháng viêm cải thiện hơn COS. Ngoài ra, COS phân đoạn 1-3 kDa có vai trò prebiotic đối với hai vi khuẩn probiotic Lactobacillus plantarum và Lactobacillus acidophilus tại nồng độ 1 mg/ml. So với FOS và Inulin thương mại, COS 1-3 kDa có hiệu quả kích thích sự phát triển hai lợi khuẩn probiotic tương đương và cao hơn.
2. Những kết quả mới của luận án
- Nghiên cứu đã xác định các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân như nhiệt độ 49oC, pH 5,9; nồng độ cơ chất 0,76%, hoạt độ cellulase 8,97 UI/g và thông số tối ưu trong quá trình sấy phun tạo bột COS như nhiệt độ 138oC, nồng độ chất khô 14,3%, lưu lượngnhập liệu 5,2 mL/phút.
- Nghiên cứu đã tổng hợp thành công bốn dẫn xuất chitooligosaccharide ghép nhóm acid phenolic như GA-COS, SA-COS, CA-COS, FA-COS với các điều kiện thu nhận bột dẫn xuất có hoạt tính tốt nhất như tỷ lệ cơ chất COS:acid phenolic là 1:0,5; pH 5; nhiệt độ 27oC; thời gian phản ứng tổng hợp là 6 giờ.
- Các dẫn xuất mới GA-COS, SA-COS, CA-COS, FA-COS cho thấy hoạt tính kháng oxi hóa được cải thiện đáng kể so COS. Trong đó có hoạt tính kháng oxi hóa của GA-COS là tốt nhất. COS và các dẫn xuất đều có vai trò là chất kháng viêm thể hiện qua tác dụng làm giảm hàm lượng NO, ức chế biểu hiện gen COX-2, iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α, ức chế biểu hiện protein trong con đường tín hiệu MAPK như iNOS, ERK1/2, p38, JNK và MNK, ức chế biểu hiện protein p50 và p65 trong con đường NF-kB/IkB, các dẫn xuất cho thấy có hiệu quả kháng viêm cải thiện hơn COS.
- COS phân đoạn 1-3 kDa có vai trò prebiotic đối với hai vi khuẩn probiotic Lactobacillus plantarum và Lactobacillus acidophilus tại nồng độ 1 mg/ml. So với FOS và Inulin thương mại, COS 1-3 kDa có hiệu quả kích thích sự phát triển hai lợi khuẩn probiotic tương đương và cao hơn.
3. Các ứng dụng/ khả năng ứng dụng trong thực tiễn hay những vấn đề còn bỏ ngỏ cần tiếp tục nghiên cứu
- Mở rộng khảo sát biểu hiện gen và protein trên các yếu tố kháng viêm khác như IL-4, IL-8, IL-10.
- Khảo sát khả năng kháng viêm của COS (1-3 kDa) và các dẫn xuất in vivo ở chuột và đánh giá độc tính bán trường diễn của các dẫn xuất.
- COS phân đoạn 1-3 kDa có vai trò prebiotic tiềm năng cho nghiên cứu ứng dụng vào các sản phẩm thực phẩm dạng bột, các sản phẩm nước giải khát đồ uống không cồn.